• 專(zhuān)科分類(lèi)： 生長(zhǎng)發(fā)育檢查
• 檢查分類(lèi)： 生化檢查
• 適用性別： 男女均適用
• 是否空腹： 　空腹
• 手術(shù)參考價(jià)： 35元
• 科　室： 生長(zhǎng)發(fā)育檢查

厭氧菌的分離與鑒定是對(duì)氧敏感度高的細(xì)菌進(jìn)行分離與鑒別的試驗(yàn)，因?yàn)閰捬跷⑸镌谧匀唤绶植紡V泛，種類(lèi)繁多，其生理作用日益受到人們的重視。專(zhuān)性厭氧菌，對(duì)氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的關(guān)鍵是提供無(wú)氧和低氧化還原電勢(shì)的培養(yǎng)環(huán)境。

分離

(1)編號(hào)

取五支無(wú)菌水試管，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-1、10-2……10-5。

(2)稀釋

在無(wú)氧無(wú)菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無(wú)菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無(wú)菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計(jì)數(shù)。

(3)滾管分離

1)滾管

將無(wú)氧無(wú)菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當(dāng)培養(yǎng)基從瓶中取出時(shí)，要用N2在培養(yǎng)基內(nèi)中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內(nèi)空氣，然后把培養(yǎng)基加入管內(nèi)，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內(nèi)，及時(shí)拔出充氣針頭。用無(wú)菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度各0.1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤(pán)中迅速滾動(dòng)，帶菌的溶化瓊脂在試管內(nèi)壁會(huì)即刻形成凝固層。

2)分離純化

生成的菌落需挑取出來(lái)，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養(yǎng)物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養(yǎng)物為止。待挑取的單菌落預(yù)先在放大鏡下觀察確定，做好標(biāo)記。然后將培養(yǎng)基試管固定于適當(dāng)?shù)闹Ъ苌希蜷_(kāi)試管膠塞，同時(shí)迅速將氣流適當(dāng)、火焰滅過(guò)菌的氮?dú)忾L(zhǎng)針頭插入管內(nèi)。同時(shí)，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過(guò)菌的通氣針頭。將準(zhǔn)備好的彎頭毛細(xì)管小心插入固體培養(yǎng)基內(nèi)，找準(zhǔn)待挑菌落，輕輕吸取，轉(zhuǎn)移至液體試管內(nèi)，加塞。37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h或更長(zhǎng)時(shí)間或待培養(yǎng)液混濁后檢查已分離培養(yǎng)物的純度。

3)劃線(xiàn)分離

將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線(xiàn)后的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因?yàn)镃O2比空氣重，開(kāi)啟后管塞不致有空氣殘留。劃線(xiàn)后的滾管，置34-37度下培養(yǎng)，便可長(zhǎng)出菌落。

菌種的鑒定

1糖發(fā)酵試驗(yàn)

糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是最常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們?cè)诜纸馓堑哪芰ι嫌泻艽蟛町?，有些?xì)菌能分解糖并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來(lái)斷定。在配制培養(yǎng)基時(shí)預(yù)先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：

①將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗?，充足氮?dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后觀察各管中液體顏色變化及產(chǎn)氣情況。

2蛋白質(zhì)分解實(shí)驗(yàn)

①將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗校渥愕獨(dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后各管分別進(jìn)行米倫氏反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、黃色反應(yīng)和坂口反應(yīng)等。

3淀粉水解實(shí)驗(yàn)

①將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。

②將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗?，充足氮?dú)夂蠓湃?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

③24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。